环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。大量研究表明，ceRNA机制在血液学疾病中起着重要的作用。在2022第27届欧洲血液学会（EHA）年会上，山东中医药大学第二附属医院肿瘤中心主任崔兴教授团队报告了一项研究（大会摘要号：P1305），探讨了circRNA、IL18与肠道aGVHD之间的关系。本刊特邀请崔教授为我们分享了该项研究的主要成果及其临床意义。
编者按：环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。大量研究表明，ceRNA机制在血液学疾病中起着重要的作用。在2022第27届欧洲血液学会（EHA）年会上，山东中医药大学第二附属医院肿瘤中心主任崔兴教授团队报告了一项研究（大会摘要号：P1305），探讨了circRNA、IL18与肠道aGVHD之间的关系。本刊特邀请崔教授为我们分享了该项研究的主要成果及其临床意义。
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研究背景
急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后一种可致命的并发症，患者胃肠系统受aGVHD影响很大，肠道aGVHD主要表现为顽固性腹泻、严重绞痛、血肿和肠梗阻等，严重可能危及生命。既往研究发现，胃肠aGVHD患者IL-18表达水平显著升高，并且证明IL18是该疾病特异性临床症状的相关因素。
近年来，circRNA已被证明在aGVHD中发挥了重要作用，但非编码RNA在外周血单核细胞（PBMC）在aGVHD中具体作用机制的研究仍然相对罕见。因此，我们对aGVHD患者PBMC中的circRNA进行序列，建立circRNA谱，并将这些数据与患者临床症状相结合，探讨circRNA、IL18与肠道aGVHD之间的关系。
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研究方法
本研究4名肠道aGVHD患者和4名健康志愿者在清晨空腹抽取外周血。在此操作后获得PBMC，经过进一步的检测和纯化，从中获得符合实验要求的RNA。在通过高通量测序以及数据处理筛选出表达水平异常的circRNA后，我们进一步将样本量扩大到20名患者，并通过qRT-PCR验证这20名患者中特定circRNA的水平。
接下来，我们利用GO、KEGG和miRanda构建了ceRNA交互网络进行了聚类分析；通过双荧光素酶活性分析来评估circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络的合作伙伴之间，存在直接相互作用关系。最后，收集临床患者数据进行数据分析，以确定肠道aGVHD相关指标对疾病诊断的敏感性和特异性。
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研究结果
高通量测序结果显示，相对于HC组，aGVHD组共有330个circRNAs呈现双向表达趋势（FC≥2.0，P≤0.05）（图1 A）。PCR验证结果显示，hsa_circ_0001599在aGVHD组的平均表达水平是对照组的两倍以上（图1 B）。
图1. A）火山图显示了在aGVHD患者和健康人中存在差异表达的circRNA；B）PCR检测证实了hsa_circ_0001599在肠道aGVHD患者的PBMCs中存在高水平表达。
通过GO和KEGG富集分析预测发现，aGVHD组样本中表达显著上调的circRNA与炎症因子的功能密切相关，circRNA表达的上调可能与肠道aGVHD的发生发展有关（图2 A）。利用miRanda、TargetScan和其他数据库，构建了ceRNA相互作用网络（图2 B），分析表明hsa_circ_0001599的过表达可能通过下游的miRNAs-IL18轴来诱导aGVHD的发生发展。接着分析了15名肠道aGVHD患者的临床特征与hsa_circ_0001599及IL18之间的关系。结果显示，hsa_circ_0001599的水平与肠道aGVHD患者的IL18水平均呈正相关（R2=0.832，P<0.05，图2 C）。
图2. A）具有显著差异表达的circRNA的GO和KEGG分析结果；B）ceRNA相互作用网络图；C）hsa_circ_0001599、IL18与aGVHD患者临床数据之间关系数据分析图。
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研究结论
hsa_circ_0001599表达上调可能导致激活ceRNA机制，调控miRNA和下游靶基因IL8，通过炎症因子相关通路诱导肠道aGVHD的发展。hsa_circ_0001599在PBMCs中的异常表达可能是一个新的诊断标志物和肠道aGVHD的治疗目标。
研究者说
近年来，随着全球血液病恶性疾病的患病率逐年增加，选择allo-HSCT的患者数量也在增加。肠道aGVHD是患者选择移植后最致命的早期并发症之一，不仅导致严重的顽固性腹泻、肠梗阻、肠绞痛等，给患者造成巨大的痛苦，严重者甚至可能危及生命。
许多研究证明，炎性因子风暴是肠道 aGVHD发生的关键原因之一，预处理产生的损伤及供体T细胞活化均可产生大量炎性因子损伤组织。其中预处理过程中释放出的肠道脂多糖通过受损的肠黏膜渗漏，刺激单核细胞分泌出炎性细胞因子，导致了细胞因子风暴，从而破坏胃肠道上皮细胞，造成肠道aGVHD。IL18作为一种炎性细胞因子，其水平被证明在aGVHD的发展过程中持续升高，参与内皮细胞激活和功能障碍，与该疾病的临床症状以及病情发展密切相关。
circRNA在基因功能和调控的各个层面都发挥着重要作用，被认为是人类疾病的理想生物标志物。circRNA包含编码蛋白的外显子，与同源的mRNA具有大量的相同序列，能够与其互为ceRNA，作为海绵吸附microRNA，调控下游靶基因表达水平。有研究证明了，circRNA可以通过ceRNA机制调控炎症性肠病。
我们的这项研究结果表明，hsa_circ_0001599可以通过ceRNA机制调控肠道aGVHD的疾病进程，它不仅可以作为诊断肠道aGVHD的理想候选生物标志物，亦有可能在临床应用于抑制aGVHD的发生发展，减轻患者痛苦，提高allo-HSCT后的生存率。
崔兴 教授
山东中医药大学第二附属医院肿瘤中心主任，教授，医学博士后，硕士研究生导师
泰山学者青年专家，美国艾奥瓦大学访问学者。先后主持国家自然科学基金3项，中国博士后科学基金特别资助1项，中国博士后科学基金面上项目1项，山东省重点研发计划1项，山东省自然科学基金青年基金1项，山东省医药卫生科技发展计划1项，山东省中医药科技发展计划1项，济南市青年科技明星计划1项。先后发表论文四十余篇，其中SCI论文16篇，总IF：50余分，主编著作2部，参编著作3部。获得3项省级以上、7项厅局级科技奖励。从事中医、中西医结合教学、临床和科研工作近20年，在研项目包括中药干预线粒体自噬介导的多发性骨髓瘤及相关合并症、温阳化瘀法干预外泌体circRNA介导多发性骨髓瘤病变、黄芩汤调控线粒体自噬通路干预aGVHD等等内容。
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