编者按：CRISPR/Cas9系统是当今基因编辑领域最热门的明星工具，科学家们在建立CRISPR/Cas9基因编辑技术之后，该技术得到广泛利用。自2014年以来，多篇CNS（Cell、Nature、Science）文章连续报道了基于CRISPR/Cas9系统的高通量筛选，利用该筛选技术，研究人员在药物靶标发现、基因功能研究、药物敏感与耐药基因研究等领域取得了巨大成功。2017年6月，在第14届国际淋巴瘤大会（ICML）上，美国国立卫生研究院Staudt教授研究团队的一项研究对ABC-DLBCL淋巴瘤细胞进行了全基因组范围的CRISPR/Cas9筛选，并在ABC-DLBCL淋巴瘤细胞中发现了B细胞受体（B-cell receptor， BCR）/MYD88超级信号通路。本刊特邀请天津医科大学肿瘤医院张会来教授对此项突破性进展进行点评。
王先火 郎鸣晓 张会来
天津医科大学肿瘤医院淋巴瘤科
中美淋巴血液肿瘤诊治中心
MYD88是一种骨髓分化初始应答基因，它能够通过Toll样受体（Toll-like Receptor， TLR）激活核转录因子NF-κB。而MYD88的突变大多是其碱基由CTC突变为CCG，并多数发生在其与受体结合区域。这种突变将MYD88招募至TLR的胞质端，从而形成一种活化的复合物，调控着NF-κB和JAK-STAT3信号通路。多项研究显示，MYD88 L265P是存在于弥漫大B细胞淋巴瘤中的一种重要突变，尤其在ABC亚型中更为常见。
在本研究中，研究人员从近期一项伊布替尼（Ibrutinib）治疗复发难治性DLBCL淋巴瘤的II期临床试验结果出发，发现伊布替尼对ABC-DLBCL患者应答率达到37%（14/38），而对GCB-DLBCL患者应答率只有5%（1/20），前者显著好于后者（P=0.0106）。而针对BCR突变患者伊布替尼的应答率更高（55.5%，5/9），BCR突变同时伴MYD88突变患者伊布替尼的应答率甚至高达80%（4/5）即伊布替尼对同时伴有CD79B突变和MYD88突变的ABC-DLBCL患者尤为有效。故研究人员提出：BCR信号通路和MYD88信号通路可能功能耦合。
建立在以上假设基础之上，研究人员对8株DLBCL细胞系进行了全基因组范围的CRISPR/Cas9筛选，结果显示在MYD88突变ABC-DLBCL细胞中，TLR9是MYD88唯一的结合受体，并仅限于ABC亚型DLBCL淋巴瘤，而该亚型淋巴瘤高度依赖于MYD88 L265P突变和慢性活化的BCR信号通路。此外，研究人员还发现TLR9与IgM共沉淀，TLR9与MYD88 L265P之间的关联依赖于慢性活化的BCR信号通路，该现象引导研究人员继续去探索慢性活化的BCR信号通路与TLR9之间的链接关系。于是他们利用邻位连接技术（PLA）去观察TLR9与BCR蛋白之间的相互作用，并在Lamp1阳性溶酶体中证实了TLR9与BCR彼此关联。
除此之外，研究人员还将MYD88 L265P异构体融合到BioID2中，BioID2是一种生物素连接酶，它能将生物素粘附在邻近蛋白上。当稳转该融合质粒并在ABC-DLBCL细胞中表达时，同样采用PLA技术证实了MYD88与CARD11和MALT1密切相关，而CARD11和MALT1是BCR信号下游CARD11-BCL10-MALT1（CBM）复合物的重要组成部分。研究人员还在ABC-DLBCL细胞中观察到内源性MYD88与CBM复合物所有成员可发生相互作用，这种相互作用依赖于BCR和TLR9。
最后，研究人员在表达MYD88 L265P-BioID2的ABC-DLBCL细胞中发现，大量复合物中具有MYD88信号，这些复合物含有活化NF-κB的信号，它们可被BTK抑制剂伊布替尼所阻断。
这些结果证实了TLR9和IgM促进了包括MYD88和BCR信号下游CBM复合物在内的超级信号通路的形成，并共同驱动了ABC-DLBCL淋巴瘤中NF-κB癌基因的激活。这些超级复合物显然产生了一个高度关联的表型，这种表型存在于伴有CD79B突变和MYD88 L265P突变的ABC-DLBCL淋巴瘤患者中，而伊布替尼对此类患者尤为有效。
然而，在BCR依赖性与BCR非依赖性的ABC亚型DLBCL中，存在两条重要的信号通路：PI3K/AKT信号通路与NF-κB信号通路。2017年1月Cancer Cell报道，在ABC亚型的弥漫大B细胞淋巴瘤中，同时抑制PI3Ka与PI3Kd的疗效强于对BTK抑制剂的疗效，其作用机制是阻断了由突变的CD79、CARD11以及MYD88引发的NF-κB的活化，并且PI3Ka/d抑制剂在伊布替尼耐药的ABC亚型PDX模型中体现出了良好的疗效。该基础实验进一步在小鼠模型中证实，伊布替尼与PI3Ka/d抑制剂Copanlisib联合治疗，在CD79B与MYD88突变的的ABC亚型DLBCL模型中达到了持续的完全缓解。这些证据都提示我们，在CD79B与MYD88突变的ABC-DLBCL中，某些患者可能对伊布替尼单药即产生良好的应答，但对于另一部分疗效不佳的患者，伊布替尼与其他药物的联合治疗仍旧是亟待研究的热点之一。
此外，该研究也表明基于CRISPR/Cas9的基因筛选是探索基因功能、药物敏感性等研究的一种强大工具，可以用来发现以及证实细胞内药物敏感性的分子机理。
专家简介
张会来，医学博士，硕士研究生导师，从事肿瘤内科临床工作20年，专注于恶性淋巴瘤的分子诊断及个体化治疗研究。现任天津医科大学肿瘤医院淋巴肿瘤科主任，担任中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会常委，天津市抗癌协会淋巴瘤专业委员会主任委员，天津市抗衰老协会中青年工作委员会主任委员，天津市抗癌协会血液肿瘤专业委员会委员等。1996年毕业于天津医科大学临床医学系获学士学位，2003年获肿瘤学硕士学位，2006年获肿瘤学博士学位，2008年受瑞士政府合作发展基金资助赴南瑞士肿瘤研究所从事博士后研究，2012年赴美国佛罗里达州Moffitt肿瘤中心接受国际临床试验项目（IVSP）培训。在Blood、Oncotarget、Leukemia & Lymphoma等国内外专业杂志上发表学术论文近四十篇。主持和参与多项国家自然科学基金、国家肿瘤临床医学研究中心项目、天津市科委、卫生局和医科大学科研项目等。先后获得第二十二届亚太抗癌大会Young Investigator Award，天津市科技进步二等奖和三等奖。
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